Αμουνίνη

Το CRF αρχικά απομονώθηκε και καθαρίστηκε από τον υποθάλαμο των προβάτων από τον Vale και άλλους επιστήμονες το 1981. Η αλληλουχία αμινοξέων του είναι:
H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu{10}}Thr{{ 11}}Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met{{21 }}Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala- Του-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2
Αυτή η αλληλουχία περιέχει 41 αμινοξέα με μοριακό βάρος περίπου 4,7 kDa, με σερίνη (Ser) στο Ν-άκρο και τροποποίηση αμίδωσης αλανίνης (Ala) στο C-άκρο. Η ομολογία αμινοξέων μεταξύ CRF προβάτου και ανθρώπινου CRF είναι 95%, με διαφορές μόνο στις θέσεις 7, 10, 13, 16, 21, 23, 26, 28, 31, 34 και 38, αλλά οι λειτουργίες διατηρούνται σε μεγάλο βαθμό.

Το τριφθοροξικό CRF (προβείου) (αριθμός CAS: 79804-71-0) είναι μια ένωση άλατος που σχηματίζεται με συνδυασμό του καρβοξυλικού άκρου του CRF με τριφθοροξικό οξύ (TFA). Τα πλεονεκτήματα της τροποποίησης TFA περιλαμβάνουν:

Ενισχυμένη διαλυτότητα: Η ισχυρή όξινη ομάδα (- COCF ∝) του TFA μπορεί να αυξήσει τη διαλυτότητα των πεπτιδίων σε οργανικούς διαλύτες, διευκολύνοντας τις πειραματικές λειτουργίες.
Σταθερή πεπτιδική δομή: Το TFA μειώνει τη συσσώρευση και την αποικοδόμηση των πεπτιδίων σχηματίζοντας γέφυρες αλατιού, παρατείνοντας τον χρόνο ημιζωής-.
Διατηρήστε τη βιολογική δραστηριότητα: Το τροποποιημένο CRF μπορεί ακόμα να συνδεθεί αποτελεσματικά με τον υποδοχέα CRF (CRFR), διατηρώντας τα λειτουργικά χαρακτηριστικά των φυσικών μορίων.

Το τριφθοροξικό CRF (πρόβειο) συνήθως παρασκευάζεται με πεπτιδική σύνθεση στερεάς{{0} φάσης (SPPS), όπου οι πλευρικές αλυσίδες αμινοξέων προστατεύονται από προστατευτικές ομάδες Fmoc ή Boc, συζεύγνυνται σταδιακά για να σχηματίσουν μια γραμμική πολυπεπτιδική αλυσίδα και τελικά κόβονται με ρητίνη TFA και καθαρίζονται. Τα πρότυπα ποιοτικού ελέγχου περιλαμβάνουν:

Καθαρότητα: Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) ανιχνεύει καθαρότητα μεγαλύτερη ή ίση με 98%.
Επαλήθευση μοριακού βάρους: Η φασματομετρία μάζας (MS) επιβεβαιώνει ότι το μοριακό βάρος είναι σύμφωνο με τη θεωρητική τιμή.
Δοκιμασία βιολογικής δραστηριότητας: Επαληθεύστε την ικανότητά του να διεγείρει την έκκριση της αδρενοκορτικοτροπικής ορμόνης (ACTH) μέσω πειραμάτων in vitro κυττάρων (όπως τα κύτταρα όγκου της υπόφυσης AtT-20).

Ο υποδοχέας CRF ανήκει στην οικογένεια των συζευγμένων υποδοχέων πρωτεΐνης κατηγορίας G (GPCR), η οποία περιλαμβάνει δύο υποτύπους: CRF 1 R και CRF 2 R
CRF 1 R: Ευρέως κατανεμημένο στο κεντρικό νευρικό σύστημα (όπως ο εγκεφαλικός φλοιός, ο ιππόκαμπος, η αμυγδαλή) και οι περιφερειακοί ιστοί (όπως η υπόφυση, τα επινεφρίδια, ο πλακούντας).
CRF 2 R: εκφράζεται κυρίως στον παρακοιλιακό πυρήνα του υποθαλάμου, του coeruleus, του νωτιαίου μυελού και των περιφερικών ιστών όπως η καρδιά, τα αιμοφόρα αγγεία και η γαστρεντερική οδός.
Η ομολογία των αλληλουχιών αμινοξέων μεταξύ των δύο υποδοχέων φθάνει το 70%, αλλά υπάρχουν διαφορές στην εξειδίκευση δέσμευσης συνδέτη: το CRF1R έχει υψηλότερη συγγένεια για το CRF από το CRF2R, το οποίο τείνει να δεσμεύεται στους συνδέτες της οικογένειας Urocortin (UCN).

Μετά τη δέσμευση στον υποδοχέα, το CRF προάγει τη δραστηριότητα της αδενυλικής κυκλάσης (AC) ενεργοποιώντας την πρωτεΐνη Gs, οδηγώντας σε αύξηση των επιπέδων ενδοκυτταρικής μονοφωσφορικής αδενοσίνης (cAMP), η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση Α (PKA) και τα κατάντη μόρια σηματοδότησης όπως το CREB. Επιπλέον, το CRF μπορεί να ενεργοποιήσει τη φωσφολιπάση C (PLC) μέσω της πρωτεΐνης G q, προκαλώντας κινητοποίηση ιόντων ασβεστίου (Ca 2+) και ενεργοποίηση πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC).
Οι βασικοί κόμβοι σήματος είναι
Οδός CAMP PKA: ρυθμίζει την έκκριση ACTH, το μεταβολισμό της γλυκόζης και την έκφραση γονιδίων.
Ca ² ⁺ - οδός PKC: εμπλέκεται στη ρύθμιση της νευρωνικής διεγερσιμότητας και στη συναπτική πλαστικότητα.
Οδός MAPK: μεσολαβεί σε μακροπρόθεσμες-προσαρμοστικές αποκρίσεις (όπως η νευρωνική επιβίωση) μέσω της φωσφορυλίωσης ERK1/2.

Η μακροχρόνια έκθεση σε CRF μπορεί να οδηγήσει σε απευαισθητοποίηση των υποδοχέων, που εκδηλώνεται ως μειωμένη αποτελεσματικότητα σύζευξης πρωτεΐνης G και φωσφορυλίωση του υποδοχέα. Η απευαισθητοποίηση του CRF1R βασίζεται κυρίως στην ενδοκυττάρωση που προκαλείται από - αρεστίνη, ενώ η αποτελεσματικότητα της ενδοκύττωσης του CRF2R είναι σχετικά χαμηλή, η οποία μπορεί να σχετίζεται με διαφορές στον υποκυτταρικό εντοπισμό του υποδοχέα. Μετά την ενδοκυττάρωση, οι υποδοχείς μπορούν να ανακυκλωθούν στην κυτταρική μεμβράνη ή να εισέλθουν στα λυσοσώματα για αποικοδόμηση, η οποία είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της λειτουργικής ομοιόστασης των υποδοχέων.